Phản ứng chuỗi polymerase – Wikipedia tiếng Việt

Từ DNA ở một sợi tóc, hoàn toàn có thể khuyếch đại lên một lượng DNA vô cùng nhiều đủ để điều tra và nghiên cứu .

Phản ứng chuỗi pôlimeraza là thuật ngữ dịch từ tiếng Anh: Polymerase Chain Reaction (viết tắt là PCR) dùng để chỉ một kỹ thuật được sử dụng để “khuếch đại” phân tử DNA hoặc đoạn phân tử DNA ngoài cơ thể sống, làm tăng số lượng DNA ban đầu lên lượng tuỳ ý muốn.[1][2][3][4] Thuật ngữ tiếng Anh này cũng đã được dịch ra tiếng Việt là phản ứng khuếch đại gen hay phản ứng chuỗi trùng hợp.[5][6] Hiện nay, ở Việt Nam cũng như ở nhiều quốc gia khác, trong tài liệu chuyên môn hay tài liệu đại chúng, thường hay dùng từ viết tắt là PCR để chỉ kỹ thuật này.

PCR là một kỹ thuật trong công nghệ sinh học, do Kary Mullis phát minh ra vào năm 1983,[7] đến nay đã được hoàn thiện qua nhiều cải tiến và được tự động hoá hoàn toàn. Kỹ thuật này vận dụng các kiến thức sinh học phân tử, nhằm tạo ra vô số bản sao (tức khuếch đại) từ đoạn DNA ban đầu (bản gốc) có khi rất nhỏ với số lượng tối thiểu mà không cần sử dụng các sinh vật sống (như E. coli và nấm men thường dùng đương thời). PCR đã được sử dụng rất phổ biến và là công cụ không thể thiếu trong nghiên cứu DNA thuộc lĩnh vực sinh học, y học, tội phạm học, xác định huyết thống,… phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng tội phạm, nghiên cứu bệnh nhiễm trùng và gần đây là xét nghiệm Covid 19 cũng như giúp sản xuất văcxin chống đại dịch này.[8][9]

Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.

DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực thi công dụng nhân DNA khi tế bào phân loại. Nó thao tác bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ trợ. Theo quy trình tiến độ PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực thi trong ống nghiệm ( in vitro ). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị tàn phá thế cho nên cần bổ trợ enzyme sau mỗi quy trình tiến độ nung nóng của mỗi chu kỳ luân hồi. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu suất cao cao vì nó mất nhiều thời hạn, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục quan tâm suốt trong quy trình PCR .Sau đó, quá trình gốc này được tăng trưởng bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi trùng thermophilic ( ưa nhiệt ) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110 °C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable ( không thay đổi ở nhiệt độ cao ) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ luân hồi, quy trình sao chép DNA hoàn toàn có thể đơn thuần và tự động hóa hơn .

Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.

Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR[sửa|sửa mã nguồn]

Kỹ thuật PCR được cấp bằng bản quyền sáng tạo cho Certus Corporation, nơi Mullis thao tác khi ý tưởng ra kỹ thuật. Kỹ thuật enzyme Taq polymerase cũng được gồm có trong bằng bản quyền sáng tạo này. Họ đã hứng chịu nhiều vụ kiện cáo tương quan tới kỹ thuật này, vụ nổi tiếng nhất là từ DuPont. Công ty dược phẩm Hoffmann-La Roche mua quyền sở hữu văn bằng bản quyền trí tuệ này vào năm 1992 và hiện tại vẫn đang nắm giữ chúng .

Thực nghiệm PCR[sửa|sửa mã nguồn]

Figure 1: PCR machine: PCR machinePCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác lập được một phần. Đó hoàn toàn có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quá trình PCR hoàn toàn có thể copy một mảnh DNA ngắn, hoàn toàn có thể lên đến 10 kb ( kb = 1 kilobasepair = kilo cặp base = 1000 cặp base ). DNA là một sợi đôi, và vì thế nó được đo với DNA bổ trợ … gọi là cặp base. Một vài giải pháp hoàn toàn có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40 kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base .Như đã thực hành thực tế lúc bấy giờ, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đó là : – DNA mẫu ( template ) chứa mảnh DNA cần khuếch đại – Cặp mồi ( primer ), để xác lập điểm mở màn và kết thúc vùng cần khuếch đại ( xem phần tiếp theo về mồi ) – DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. – Nucleotides ( ví dụ dNTP ) là nguyên vật liệu cho DNA-polymerase để kiến thiết xây dựng DNA mới. – Dung dịch đệm, phân phối môi trường tự nhiên hóa học cho DNA-polymerasePhản ứng PCR được thực thi trong chu kỳ luân hồi nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ đúng mực cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu ( natural oil ) lên trên mặt phẳng hỗn hợp phản ứng. Năm năm ngoái, giá máy khoảng chừng 140.000.000 VNĐ cho những dòng có tính năng Gradient nhiệt .
Đoạn DNA cần khuếch đại được xác lập bằng mồi tinh lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 ( thường 18-25 ) nucleotides ( vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác lập bằng số lượng cặp base ( bp ) ; chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides ) tương thích một cách đúng mực ở điểm mở màn và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và khởi đầu quy trình tổng hợp của sợi DNA mới .Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ biến tính của nó ( Tm-melting ) phụ thuộc vào vào số … Nhiệt độ biến tính của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ biến tính của DNA trong chu kỳ luân hồi tiên phong của quy trình PCR — được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho hiệu quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị số lượng giới hạn bởi nhiệt độ cần biến tính. Nhiệt độ biến tính quá cao, ví dụ như trên 80 °C sẽ gây ra nhiều yếu tố vì DNA-polymerase hoạt động giải trí kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng chừng từ 60 – 75 °C .Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn mồi này là hỗn hợp tương tự như nhưng không giống trọn vẹn. Nó hoàn toàn có thể thuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó hoàn toàn có thể là tựa như nhưng không giống nhau. Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được phong cách thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiều codon hoàn toàn có thể mã hóa cho nhiều amino acid, thường rất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt quan trọng. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với amino acid isoleucine hoàn toàn có thể là ” ATH “, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, hay cytosine. ( Xem mã di truyền để hiểu them về codons ) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa hoàn toàn có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn đề hoàn toàn có thể được xử lý bằng chiêu thức touchdown PCR .Vấn đề phong cách thiết kế mồi đúng chuẩn đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào vào sản xuất sản lượng : – hàm lượng GC nên trong khoảng chừng 40-60 % – Tính toán nhiệt biến tính cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác quá 50 °C và nhiệt biến tính của loại sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 10 °C – Nhiệt độ bám vào nhiều lúc thấp hơn nhiệt nóng chảy 50 °C. Tuy nhiên, nên lựa chọn theo kinh nghiệm tay nghề cho từng trường hợp đơn cử. – Tránh … – Kết thúc đầu 3 ’ rất nhạy cảm – nó hoàn toàn có thể không bổ trợ cho bất kỳ vùng nào của đoạn mồi trong phản ứng và phải phân phối base đúng chuẩn tương thích với mẫu. Có cả chương trình tương hỗ việc phong cách thiết kế mồi ( xem Liên kết ngoài )
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ luân hồi. Mỗi chu kỳ luân hồi gồm 3 bước ( Hình 2 )( 1 ) Nhiệt độ tăng lên 94-96 °C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ luân hồi 1, DNA thường được biến tính đến thời hạn mở chuỗi để bảo vệ mẫu DNA và mồi được phân tách trọn vẹn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian : 1-2 phút( 2 ) Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi hoàn toàn có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ quá trình này nhờ vào vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính 50 °C ( 45-60 °C ). Sử dụng sai nhiệt độ trong quy trình tiến độ này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn trọn vẹn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian : 1-2 phút .( 3 ) Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó khởi đầu bám vào và hoạt động giải trí dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là lê dài. Nhiệt độ lê dài nhờ vào DNA-polymerase. Thời gian của bước này nhờ vào vào cả DNA-polymerase và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc …, 1000 bp / 1 phút .

Figure 2: Hình 2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 96°C. (2)Gắn mồi ở 68°C. (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.

Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ chương trình PCR mà đã thành công trên phân đoạn 250bp của đầu C của insulin-like growth factor (IGF).

Hỗn hợp phản ứng gồm :

  • 1.0 µl DNA khuôn (100 ng/µl)
  • 2.5 µl mồi, 1.25 µl cho mỗi mồi(100 ng/µl)
  • 1.0 µl Pfu-Polymerase
  • 1.0 µl nucleotide
  • 5.0 µl đệm
  • 89.5 µl H2O

100 µl hỗn hợp phản ứng ( sử dụng ống eppendorf 200 μl ) được đưa vào máy PCR .Quy trình PCR gồm có những bước sau :

Bước 1
Khởi đầu. Đun hỗn hợp ở 96 °C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được làm nóng. DNA-Polymerase có thể có trong giai đoạn khởi đầu, hoặc nó có thể được thêm vào ngay sau bước này.
Bước 2
Biến tính (Melting). 96 °C trong 30 giây. Đối với mỗi chu kì thì lượng thời gian này là đủ để biến tính DNA.
Bước 3
Gắn mồi (Annealing). 68 °C trong 30 giây.
Bước 4
Kéo dài (Elongation).72 °C trong 45 giây.
Bước 5
Các bước từ 2 đến 4 được lặp lại 25 lần, tuy nhiên với mồi và polymerase tốt, 15 đến 20 chu kỳ có thể là đủ.
Bước 6
Giữ hỗn hợp ở 7 °C. Tại nhiệt độ này DNA sẽ không bị hư hại trong vòng 1 đêm.

Figure 3: PCR product compared with DNA ladder in agarose gel. DNA ladder (lane 1), the PCR product in low concentration (lane 2), and high concentration (lane 3).Image published with permission of Helmut W. Klein, Institute of Biochemistry, University of Cologne, Germany: PCR product compared with DNA ladder in agarose gel. DNA ladder ( lane 1 ), the PCR product in low concentration ( lane 2 ), and high concentration ( lane 3 ) .

Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc sử dụng sắc ký gel agarose. Sắc ký gel agarose là phương pháp bao gồm việc nhỏ mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau đó chạy điện di trên gel. Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương. Kích thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh với thang DNA, thang này có chứa các DNA đã biết trước kích thước, cũng nằm trong gel (hình 3).

Tối ưu hoá PCR[sửa|sửa mã nguồn]

Do PCR rất nhạy, nên phải tránh ô nhiễm những DNA khác có trong phòng thí nghiệm ( vi trùng, virus, DNA, … ). Vì vậy những mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và quy trình tiến độ DNA, ngoài những còn có phản ứng nghiên cứu và phân tích loại sản phẩm, nên được thực thi trong một khu vực riêng không liên quan gì đến nhau. Ở tiến trình sẵn sàng chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phải chuẩn bị sẵn sàng phòng riêng không liên quan gì đến nhau với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước PCR cũng như sửa chữa thay thế những pipet. Thuốc thử dùng trong PCR phải được sẵn sàng chuẩn bị riêng không liên quan gì đến nhau và chỉ được dùng cho mục tiêu này. Các mẫu phải được giữ riêng không liên quan gì đến nhau với những mẫu DNA khác. Phản ứng có trấn áp ( trấn áp bên trong ), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được thực thi, để kiểm tra sự nhiễm bẩn .

Recent developments in PCR techniques[sửa|sửa mã nguồn]

  • A more recent method which excludes a temperature cycle, but uses enzymes, is helicase-dependent amplification.
  • A style of PCR that reduces nonspecific primer annealing is Touchdown PCR.
  • Real-Time PCR is a quantative PCR technique.

Những ứng dụng của PCR[sửa|sửa mã nguồn]

PCR hoàn toàn có thể được ứng dụng vào nhiều mục tiêu phong phú trong những nghiên cứu và điều tra và nghiên cứu và phân tích. Một số ví dụ sẽ được nêu ở dưới .

Yếu tố di truyền[sửa|sửa mã nguồn]

Yếu tố di truyền là một kỹ thuật pháp y sử dụng để xác lập một người bằng cách so sánh DNA của người đó với mẫu đã có, ví dụ như, mẫu máu thu được từ hiện trường vụ án hoàn toàn có thể được so sánh di truyền với mẫu máu của người tình nghi. Có thể chỉ cần một lượng nhỏ DNA thu từ máu, tinh dịch, nước bọt, tóc … Về triết lý thì chỉ cần một mạch DNA đơn là đủ .

Kiểm tra huyết thống[sửa|sửa mã nguồn]

Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. (1) Father. (2) Child. (3) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. ( 1 ) Father. ( 2 ) Child. ( 3 ) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint .Mặc dù những hiệu quả ” dấu vân tay ” là duy nhất ( trừ cặp song sinh giống hệt nhau ), mối quan hệ di truyền, ví dụ, cha mẹ và con hoặc anh chị em ruột, hoàn toàn có thể được xác lập từ hai hoặc nhiều dấu vân tay di truyền, hoàn toàn có thể được sử dụng để thử nghiệm quan hệ cha con ( Hình 4 ). Một biến thể của kỹ thuật này cũng hoàn toàn có thể được sử dụng để xác lập những mối quan hệ tiến hóa giữa những sinh vật .

Chẩn đoán bệnh di truyền[sửa|sửa mã nguồn]

Phát hiện những bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quy trình lâu bền hơn và khó khăn vất vả, hoàn toàn có thể được rút ngắn đáng kể bằng cách sử dụng chiêu thức PCR. Mỗi gen trong câu hỏi hoàn toàn có thể thuận tiện được khuếch đại qua PCR bằng cách sử dụng những loại sơn lót thích hợp và sau đó trình tự để phát hiện đột biến .Bệnh virus, cũng hoàn toàn có thể được phát hiện bằng giải pháp PCR trải qua khuếch đại của DNA của virus. Phân tích này là hoàn toàn có thể ngay sau khi nhiễm trùng, hoàn toàn có thể từ vài ngày đến vài tháng trước khi những triệu chứng trong thực tiễn xảy ra. Chẩn đoán sớm như vậy cho những bác sĩ dẫn quan trọng trong điều trị .

Tách dòng gene[sửa|sửa mã nguồn]

Nhân bản một gen không nên nhầm lẫn với nhân bản hàng loạt một sinh vật-mô tả quy trình cô lập một gen từ một sinh vật và sau đó chèn nó vào sinh vật khác. PCR thường được sử dụng để khuếch đại gen, mà sau đó hoàn toàn có thể được chèn vào một vector ( vector là một phương tiện đi lại chèn một gen vào khung hình ) như một plasmid ( một phân tử DNA vòng ) ( Hình 5 ). DNA sau đó hoàn toàn có thể được chuyển thành một sinh vật khác nhau, nơi gen và mẫu sản phẩm của nó hoàn toàn có thể được nghiên cứu và điều tra ngặt nghèo hơn. Thể hiện một gen nhân bản ( biểu lộ một gen có nghĩa là để sản xuất những protein mà nó xác lập sản xuất ) cũng hoàn toàn có thể là một cách để sản xuất hàng loạt hữu dụng ví dụ protein-cho, thuốc men .

Figure 5: Cloning a gene using a plasmid.
(1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.

Gây đột biến điểm[sửa|sửa mã nguồn]

Đột biến là một cách để làm đổi khác trình tự của những nucleotide trong DNA. Có những trường hợp trong đó một là chăm sóc đến biến hóa ( biến hóa ) bản sao của một chuỗi DNA nhất định, ví dụ, khi nhìn nhận những tính năng của một gen hoặc trong ống nghiệm tiến hóa protein. Đột biến hoàn toàn có thể được đưa vào trình tự DNA sao chép theo hai cách cơ bản khác nhau trong quy trình PCR. Đột biến trang web hướng được cho phép người thử nghiệm để trình làng một đột biến tại một khu vực đơn cử trên sợi DNA. Thông thường, đột biến mong ước được tích hợp trong những mồi sử dụng cho những chương trình PCR. Đột biến ngẫu nhiên, mặt khác, dựa trên việc sử dụng những polymerase dễ bị lỗi trong quy trình PCR. Trong trường hợp đột biến ngẫu nhiên, vị trí và đặc thù của đột biến không hề trấn áp. Một ứng dụng của đột biến ngẫu nhiên là để nghiên cứu và phân tích những mối quan hệ cấu trúc công dụng của protein. Bằng cách đổi khác một cách ngẫu nhiên một chuỗi DNA, người ta hoàn toàn có thể so sánh những protein tác dụng với bắt đầu và xác lập công dụng của từng phần của protein .

Phân tích mẫu DNA cổ[sửa|sửa mã nguồn]

Sử dụng PCR, nó sẽ trở thành có thể phân tích DNA đó là hàng ngàn năm tuổi. Kỹ thuật PCR đã được sử dụng thành công trên động vật, chẳng hạn như một voi ma mút bốn mươi ngàn năm tuổi, và cũng trên DNA của con người, trong các ứng dụng khác nhau, từ việc phân tích các xác ướp Ai Cập đến việc xác định một Sa hoàng Nga.

Xác định kiểu gene của những đột biến[sửa|sửa mã nguồn]

Thông qua việc sử dụng PCR đơn cử cho alen, người ta hoàn toàn có thể thuận tiện xác lập alen nào của một đột biến hoặc đa hình một thành viên có. Ở đây, một trong hai đoạn mồi là phổ cập, và sẽ ủ cách đột biến một đoạn ngắn, trong khi những đoạn mồi khác ủ ngay trên biến thể. Đầu 3 ‘ của đoạn mồi đơn cử dành cho alen được sửa đổi, thành chỉ tổ chức triển khai nếu nó tương thích với một trong những alen. Nếu đột biến được chăm sóc là đa hình nucleotide đơn T hoặc C ( T / C SNP ), thì một phản ứng sẽ sử dụng hai phản ứng, một phản ứng chứa đoạn mồi kết thúc bằng T và phản ứng còn lại kết thúc bằng C. Đoạn mồi chung sẽ giống nhau. Sau khi thực thi PCR, hai bộ phản ứng này sẽ được triển khai trên gel agarose, và quy mô dải sẽ cho bạn biết liệu thành viên đó là T đồng hợp tử, đồng hợp tử C hay T / C dị hợp tử. Phương pháp luận này có 1 số ít ứng dụng, ví dụ điển hình như khuếch đại một số ít kiểu đơn bội nhất định ( khi một số ít alen nhất định ở 2 SNP trở lên xảy ra cùng nhau trên cùng một nhiễm sắc thể [ Trạng thái cân đối link ] ) hoặc phát hiện nhiễm sắc thể tái tổng hợp và điều tra và nghiên cứu sự tái tổng hợp cộng sinh .

So sánh mức độ biểu lộ của gene[sửa|sửa mã nguồn]

Các nhà nghiên cứu sử dụng chiêu thức PCR truyền thống cuội nguồn để Dự kiến sự biến hóa trong một mẫu gene. Axit Ribonucleic ( RNA ) là phân tử mà DNA được phiên mã trước khi tạo ra protein, và những sợi RNA giữ những hướng dẫn cho trình tự protein được gọi là RNA thông tin ( mRNA ). Khi RNA được phân lập, nó hoàn toàn có thể được phiên mã ngược trở lại thành DNA ( đúng chuẩn là DNA bổ trợ, được gọi là cDNA ), tại thời gian này, PCR truyền thống cuội nguồn hoàn toàn có thể được vận dụng để khuếch đại gen, chiêu thức này được gọi là RT-PCR. Trong hầu hết những trường hợp, nếu có nhiều vật tư bắt đầu ( mRNA ) của gen thì trong quy trình PCR sẽ tạo ra nhiều bản sao của gen hơn. Khi mẫu sản phẩm của phản ứng PCR được chạy trên gel agarose ( xem Hình 3 ở trên ), một dải, tương ứng với một gen, sẽ Open lớn hơn trên gel ( chú ý quan tâm rằng dải vẫn ở cùng một vị trí so với bậc thang, nó sẽ chỉ Open béo hơn hoặc sáng hơn ). Bằng cách chạy những mẫu cDNA khuếch đại từ những sinh vật được giải quyết và xử lý khác nhau, người ta hoàn toàn có thể có được sáng tạo độc đáo chung về mẫu nào bộc lộ nhiều gen chăm sóc hơn. Một chiêu thức RT-PCR định lượng đã được tăng trưởng, nó được gọi là Real-Time PCR .

Liên kết ngoài[sửa|sửa mã nguồn]

Rate this post