Nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.28 MB, 88 trang )
Bạn đang đọc: Nghiên cứu thu nhận urease từ đậu nành – Tài liệu text
CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN VEÀ UREASE
-1-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5): [31, 35, 44]
Urease có tên hệ thống là carbamine amideohydrolase, là enzyme xúc tác
quá trình thủy phân urea thành ammoniac và khí cacbonic. Nó thuộc nhóm enzyme
hydrolase (enzyme thủy phân) [35].
Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước
quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5 trong đó:
–
Số 3: chỉ nhóm chính, là nhóm hydrolase.
–
Số 5: chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên
liên kết C-N, khác liên kết peptid.
–
Số 1: chỉ phân nhóm phụ cắt các amid
thẳng (amidohydrolase).
–
Số 5: chỉ số thứ tự của urease trong phân
nhóm phụ.
Hình 1.1: Enzyme urease
Như vậy, từ tên kí hiệu quốc tế của urease, ta có thể biết được nó là enzyme
thủy phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết C-N, không
phải liên kết peptid theo phương trình như sau [44]:
Urease là enzyme lần đầu tiên được J.B.Sumner tách
chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack bean_Canavalia ensiformis)
vào năm 1926. Và chính công trình nghiên cứu này đã đạt
giải Nobel vào năm 1946 đồng thời cũng đăït nền tảng đầu
tiên cho các công trình nghiên cứu về urease sau này [31].
Hình1.2: Tinh thể urease được
J.B.Summer chiết tách và kết tinh [31].
-2-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.1.1. Khối lượng phân tử: [21]
Khối lượng phân tử của urease được nhà nghiên cứu Joseph và Evelyn xác
đònh bằng phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m và so sánh với các protein
đã biết trước khối lượng phân tử. Kết quả cho thấy urease từ đậu nành có 2 peak
ứng với 2 phân tử lượng khác nhau đó là 540.000 Da và 420.000 Da, trong khi đó
urease từ jack bean chỉ xuất hiện 1 peak duy nhất với phân tử lượng là 480.000 Da.
Hình 1.3: Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m [21]
Như vậy, urease từ những nguồn khác nhau có khối lượng phân tử khác nhau
và ngay cả trong cùng một nguồn là đậu nành, có tới 2 loại urease. Hai loại urease
này khác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng bản chất của coenzyme vẫn không
thay đổi.
Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acid
amin. Thành phần các acid amin này không giống nhau ở những nguồn khác nhau
đã giải thích cho sự khác nhau về khối lượng phân tử như đã nói ở trên.
-3-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Bảng 1.1: Thành phần amino acid của soybean và jack bean urease [21]
a: Dữ liệu do Joseph và Evelyn khảo sát.
b: Dữ liệu để so sánh (do Staples và Reithel khảo sát).
1.1.2. Trung tâm hoạt động: [23, 26, 30]
Theo [23] thì trung tâm hoạt động của urease có chứa 2 nguyên tử Ni. Mỗi
nguyên tử Ni này được nối với 2 nguyên tử N trong vòng imidazole và 1 nhóm
carboxylate, 1 phân tử H2O (hình 1.4). Và chính 2 nguyên tử Ni này đóng vai trò rất
quan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease. Đó cũng chính là lí do mà
urease còn được gọi là “Nikel dependent enzyme”.
Hình 1.4: Trung tâm hoạt động của urease (Ni: 2 quả cầu màu xanh) [23]
-4-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Tuy nhiên urease có các nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩn
Bacillus pasteurii trong trung tâm hoạt động chứa ion kim loại Zn2+ [26], còn ở
Klebsiella aerogenes có cofactor là Cu2+ [30] như hình bên dưới:
Hình 1.5: Urease từ K. aerogenes [30]
Hình1.6: Urease từ Bacillus
pasteurii [26]
1.1.3. Cơ chế xúc tác: [42]
Cơ chế của quá trình xúc tác phản ứng của urease theo phương trình [42]:
-5-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Cụ thể xảy ra ở trung tâm hoạt động như sau:
Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của urease [42]
Theo sơ đồ trên ta thấy: ban đầu phân tử urea sẽ tấn công và tạo liên kết với
2 nguyên tử Ni đồng thời có 2 phân tử H2O được giải phóng ra. Tiếp theo là sự sắp
xếp lại của các điện tử, hình thành những mối liên kết mới tại trung tâm hoạt động.
Cuối cùng là sự tái cấu trúc ở trung tâm hoạt động của urease với sự tham gia của 2
phân tử nước, đẩy gốc carbamate ra ngoài đồng thời giải phóng 1 phân tử NH3. Như
vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni là rất quan trọng trong việc tạo liên kết giữa
enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian. Đây chính là một cofactor
của urease.
-6-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của urease: [1, 10,
14, 19, 23, 44]
1.1.4.1.
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme: [14]
Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến
V= k. [E]
tính vào nồng độ enzyme:
V
: vận tốc phản ứng
[E]
: nồng độ enzyme
Cũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng
chậm.
1.1.4.2.
nh
hưởng
của
nồng
độ
cơ
chất,
Michaelis_Menten: [14, 44]
Phương trình Michaelis_Menten:
v=
v max × [ S ]
K m + [S ]
Trong đó:
Km
: hằng số Michaelis, là hằng số ái
lực của enzyme đối với cơ chất, đặc
trưng của mỗi loại enzyme đối với mỗi
loại cơ chất.
vmax
: vận tốc phản ứng đạt cực đại.
[S]
: nồng độ cơ chất
Từ phương trình ta có thể xét đến 3 trường hợp:
–
Nếu [S] << Km thì:
v=
v max × [ S ]
Km
Như vậy, ở nồng độ cơ chất thấp, v phụ thuộc tuyến tính vào [S]
-7-
mô
hình
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
–
Nếu [S] >> Km thì: v = vmax: tức vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ
thuộc [S]. Như vậy [S] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], v
cũng không tăng theo.
–
Nếu [S] = Km thì v =
v max
: vận tốc phản ứng bằng nửa vận tốc cực đại.
2
Hoặc ta cũng có thể xác đònh Km và
Vmax theo phương trình được viết lại từ phương
trình trên như sau:
K
1
1
1
=
+ m ×
vi v max v max [ S ]
Từ đó ta sẽ biểu diễn sự phụ thuộc của
1
1
theo
bằng một phương trình đường
vi
[S ]
thẳng và xác đònh Km, Vmax như đồ thò bên.
Trên cơ sở đó, một thí nghiệm của trường đại học Regensburg (Đức) việc
xác đònh Km, Vmax có kết quả như sau [44]:
Kết quả suy ra từ đồ thò (hình 1.8):
400C
500C
Km (mol.L-1)
2.41 * 10-2
2.41 * 10-2
Vmax (mS.min-1)
0.5118
0.7868
-8-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Hình 1.8: Đồ thò xác đònh Km và Vmax ở hai nhiệt độ khác nhau [44]
(1): ở 400C
1.1.4.3.
(2): 500C
nh hưởng của nhiệt độ: [14, 17, 23, 44]
Giống như phản ứng hóa học, khi nhiệt độ tăng, vận tốc chuyển động của
các phân tử tăng, sự tiếp xúc giữa các phân tử cũng tăng nên vận tốc phản ứng
tăng.
Tuy nhiên do bản chất enzyme là protein nên nhiệt độ cao sẽ làm biến tính
protein, enzyme mất hoạt tính. Do đó, mỗi enzyme sẽ tồn tại một nhiệt độ mà ở đó
hoạt tính cao nhất, gọi là: nhiệt độ tối thích topt.
Theo các nghiên cứu từ đậu rựa (jack bean) thì nhiệt độ topt vào khoảng 4550 C [17]. Tuy nhiên nhiệt độ topt của urease không cố đònh, mà nó phụ thuộc vào
nhiều yếu tố như: nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian
phản ứng…
0
Người ta đã thấy rằng độ bền nhiệt của urease tăng khi có mặt cơ chất hoặc
L_cystein và urease ở dung dòch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệt
nhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [23].
nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng không bò biến tính.
-9-
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
topt
Cũng là một thí nghiệm của trường đại học Regensburg (Đức) đã xác đònh
được thực hiện dưới thiết bò sau [44]:
Hình 1.9: Thiết bò thí nghiệm xác đònh topt của urease [44]
Theo sơ đồ trên, nhiệt độ sẽ được đo ở (2) với sự trợ giúp của tế bào bán dẫn
(1) và tất cả được nối với bộ điều kiển gọi là CHEMBOX. Nhiệt độ sẽ được khảo
sát ở 20, 30, 40, 50, 600C. Kết quả thu được của các nhà nghiên cứu này là topt =
500C như đồ thò hình bên:
Hình 1.10: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính urease [44]
– 10 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.1.4.4.
Ảnh hưởng của pH: [14, 19]
Enzyme rất nhạy cảm với sự biến đổi pH của môi trường do pH ảnh hưởng đến
sự phân ly ion của phân tử cơ chất. Do đó mỗi enzyme có một pH mà hoạt tính của
nó đạt cực đại, gọi là pH tối thích (pHopt). Khi pH càng xa pHopt thì hoạt tính càng
giảm [2].
Bảng 1.2: Giá trò pHopt ở các loại đệm [19]
Nồng
độ Loại đệm
pHopt
urea 8% và bằng 7.5 khi nồng độ urea là
urea (%)
2.5
0.1
Urease có pHopt = 6 khi nồng độ cơ chất
Acetate
6.4
1% [19]. Điều này cho thấy giá trò pH tối
Citrate
6.5
ưu của urease cũng không cố đònh mà nó
Phosphate
6.9
còn phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt
Acetate
6.7
độ cũng như vào nguồn nguyên liệu thu
Citrate
6.7
nhận.
Phosphate
7.6
Theo các tài liệu thì giá trò pH tối ưu của
urease nằm trong khoảng 6.4-7.6. Như vậy, hoạt tính của urease phụ thuộc vào
dung dòch đệm, giá trò pH, nồng độ urea, nhiệt độ và nồng độ muối (bảng 1.2).
Hình 1.11: Giá trò pHopt ở nồng độ urea 2.5 % của các loại đệm [19]
– 11 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.1.4.5.
Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất ức chế: [10, 14, 23, 27]
Mỗi enzyme đều tồn tại một số hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặt
của chúng có khả năng kích thích hoặc kìm hãm hoạt động của enzyme, gọi là chất
kích thích (chất hoạt hóa) và chất kìm hãm (chất ức chế). Tuy nhiên không có sự
phân biệt rõ ràng chất ức chế và kìm hãm vì một chất có thể là kích thích với
enzyme này nhưng là kìm hãm của enzyme khác hoặc ở nồng độ này là kích thích,
nồng độ khác là kìm hãm [14].
™ Cơ chế tác dụng của chất hoạt hóa: [14]
Các chất hoạt hóa có thể là chất biến enzyme từ trạng thái không hoạt động
sang trạng thái hoạt động, có thể là các chất dò lập thể dương hoặc các chất có khả
năng biến tiền enzyme không hoạt động sang hoạt động mạnh. Các chất này có thể
là các ion kim loại, có thể đóng vai trò nhóm ngoại của các enzyme 2 cấu tử hoặc
tham gia vào cấu tạo của coenzyme, hoặc là cầu nối giữa enzyme với cơ chất, hoặc
là cầu nối giữa phần apoenzyme với coenzyme.
™ Cơ chế tác dụng của chất kìm hãm: [14]
Các chất kìm hãm ngược lại là các chất có tác dụng biến enzyme từ trạng
thái hoạt động sang không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang hoạt
động yếu. Các chất này có thể là dò lập thể âm, tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh
tranh và không cạnh tranh.
–
Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra trong trường
hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương đồng
với cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết
hợp với enzyme, giảm mối liên kết giữa
enzyme và cơ chất.
–
Kìm hãm không cạnh tranh: xảy ra trong
trường hợp chất kìm hãm có khả năng kết
hợp với enzyme hoặc cơ chất, có thể là ion
kim loại cùng hóa trò với các ion kim
loại là nhóm ngoại của enzyme.
Hình 1.12: Ảnh hưởng của chất kìm hãm
cạnh tranh và không cạnh tranh.
– 12 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Theo [28], các ion kim loại như Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+… là những chất kìm
hãm không cạnh tranh vì nó có hóa trò cùng với cofactor của urease là Ni2+. Các ion
kim loại này sẽ tranh giành các liên kết với Ni2+, và do đó sẽ làm “khóa”ù trung tâm
hoạt động của urease.
Bảng 1.3: Ảnh hưởng của các chất ức chế lên hoạt tính urease [28]
Theo bảng trên, với hàm lượng AgNO3 0.002mg/ml đã làm mất hoạt tính của
urease, đối với HgCl2 là 0.004mg/ml và đối với Cu2+ là 0.01mg/ml.
Ngoài ra, hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là
những chất ức chế đặc hiệu cạnh tranh của urease. Vì chúng có cấu tạo gần giống
cơ chất nên chúng cũng có khả năng kết hợp với enzyme. Do đó sự có mặt của
chúng trong dung dòch làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân urea. Có thể làm giảm
tác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea [23].
™ Ví dụ với chất ức chế là hydroxamic acid [23]:
– 13 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Cụ thể như sau:
Hình 1.13: Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease [23]
Hydroxamic acid do có cấu tạo gần giống urea nên nó tấn công vào trung
tâm hoạt động của urease là 2 quả cầu Ni và đã “khóa” chặt 2 quả cầu này.
– 14 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.2. Các phương pháp thu nhận urease:
1.2.1. Nguồn thu nhận: [8, 9, 11, 17, 21, 24, 31]
Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu
khác nhau.
Vào năm 1876, Musculus lần đầu tiên trình bày báo cáo về enzyme urease.
Ông lọc lấy vi khuẩn trên giấy lọc, làm khô giấy, sau đó thấm ướt bằng dung dòch
chỉ thò acid_base để kiểm tra urea. Ông cũng tìm thấy urease có trong nước tiểu [8].
Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là trong các
vi sinh vật đất, trong thực vật và một số ít ở động vật. Ông đã tìm ra ở hơn 200 loài
vi khuẩn, nhiều loại nấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao. Các vi khuẩn có
chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài,
chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và
Bacilaceae [31].
Năm 1922, Przylecki tìm thấy urease trong gan của động vật thân mềm,
trong một số loài ấu trùng và loài giáp xác. Ngoài ra urease còn được tìm thấy ở
con Sam (Limulus polyphemus) và ở ấu trùng của ruồi Lucilia sericata [31].
Các loại cây họ Đậu như đậu rựa, đậu nành, đậu ngự, đậu rằn đều có chứa
một lượng đáng kể urease. Trong các loại đậu kể trên thì đậu rựa (jack bean) chứa
một lượng urease rất lớn, tới gần 20% trọng lượng chất khô của hạt [31].
Đậu rựa có nguồn gốc từ Ấn Độ. Ở nước ta, giống đậu rựa được trồng nhiều
ở miền Bắc, ở miền Nam có giống đậu rựa leo. Hạt đậu rựa độc, ăn say do trong
hạt có chứa chất Concanavalin là chất độc. Nó phân lập immunoglobulin và
glucoprotein trong máu, làm giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng qua ruột non
[9]. Vì lí do trên nên ở nước ta đậu rựa ít được trồng nhiều.
So với 3 loại đậu còn lại: đậu rằn, đậu ngự, đậu nành thì đậu nành có chứa
một lượng urease lớn hơn cả và cho hoạt tính cao hơn 2 loại còn lại [8]. Đậu nành
do có giá trò dinh dưỡng cao nên được trồng khá phổ biến ở nước ta, giá thành lại rẻ
nên rất thích hợp được dùng làm nguyên liệu để nghiên cứu thu nhận urease trong
khuôn khổ luận văn này.
– 15 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.2.1.1.
Cây đậu nành (Glycine max Merill): [5, 7, 9, 37]
Cây đậu nành là một trong số cây trồng có lòch sử lâu đời nhất của loài người.
Theo thống kê của FAO (1994), đậu nành được phân loại thực vật học như sau:
Bảng 1.4: Phân loại thực vật học của cây đậu nành [37]
Phân giới
Cormobinata
Họ
Leguminosae
Phân loại
Spermatophyta
Phân họ
Xem thêm: Enzyme Pectinase Là Gì
Papilionaceae
Tông
Phaseoleae
Phân hiệu (chi) Angcospermae
Lớp
Dicotyldoneeae
Phân tông
Phaseolinae Glycininae
Phân lớp
Archichlamydae
Giống
Glycine L
Thứ
Rosales
Phân giống
Glycine Subg, Soja
Phân họ
Leguminosinae
Loài
Glycine max
Hình 1.14: Cây đậu nành, quả và hạt [37]
– 16 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.2.1.2.
Hạt đậu nành: [5, 7, 9, 37]
Hạt đậu nành, cũng như hạt của nhiều họ đậu khác, không có nội nhũ mà chỉ
có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Tùy theo giống, hình dạng của hạt có thể
biến đổi từ hình cầu, dẹt, dài và hầu hết là có hình ô van [7].
Hạt đậu nành gồm ba bộ phận [7]:
–
Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt.
–
Rốn hạt chiếm 2% trọng lượng hạt.
–
Phôi trưởng thành gồm hai lá mầm chiếm 90% trọng lượng hạt.
Hình 1.15: Cấu tạo của hạt và phôi đậu nành [37]
1.2.1.3.
Thành phần hóa học của đậu nành: [4, 7]
Đậu nành được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để giải quyết nạn
thiếu protein trong dinh dưỡng của con người. Ngoài ra, đậu nành còn được dùng để
chữa bệnh tiểu đường, suy nhược thần kinh, suy nhược dinh dưỡng [7].
Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là
tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều [7].
– 17 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Bảng1.5: Thành phần hóa học của đậu nành tính trên tổng khối lượng hạt [4]
Thành phần hóa học
.
% Khối lượng
Protein
40.0
Chất béo
20.0
Carbohydrate
Cellulose
4.0
Hemicellulose
15.0
Đường
Stachyose
3.8
Rafinose
1.1
Saccharose
5.0
Đường khác (arabinose, glucose…) 5.1
Viatamin và khoáng
6.0
™ Protein:
Hàm lượng protein tổng dao động trong hạt đậu nành từ 29.6–50.5%, trung
bình là 36–40%. Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein): albumin
(6–8%), globulin (25–34%), glutelin (13–14%), prolamin chiếm lượng nhỏ không
đáng kể. Gần 80% protein có trong hạt có thể tách riêng ra ngoài nhờ vào phương
pháp sử dụng kiềm.
™ Lipid:
Chất béo trong đậu nành dao động từ 13.5–24% theo hàm lượng chất khô,
trung bình 18%. Chất béo chứa khoảng 6.4–15.1% acid béo no (acid stearic, acid
arachidic) và 80–93.6% acid béo không no (acid linoleic, acid linolenic, acid oleic
trong đó acid linolenic chiếm tỷ lệ tương đối cao). Chất béo không no có lợi cho
sức khỏe hơn là acid béo no. Tuy nhiên các acid béo không no dễ bò oxy hóa và
làm giảm chất lượng dầu nành.
Dầu nành được tiêu hóa dễ dàng với thành phần các acid béo không no,
không có cholesterol và các acid béo không thay thế như acid linoleic, acid
linolenic và acid arachidonic … có vai trò sinh học cao đối với con người.
– 18 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Bảng 1.6: Hàm lượng acid béo trong đậu nành [4]
Acid béo no
Hàm lượng (%) Acid béo không no
Hàm lượng (%)
Lauric C12: 0
0-0.2
Palmitoleic C16:1
0.42-1.6
Myristic C14: 0
0.1-0.4
Oleic C18:1
10.9-60
Palmitic C16: 0
5.5-6.5
Linoleic C18: 2
25-64.8
Stearic C18: 0
2.4-5.5
Arachidonic C20: 4
–
Arachidic C20: 0
0.2-0.9
Linolenic C18: 3
0.3-12.1
Behenic C22: 0
–
Tổng cộng
15
Tổng cộng
85
™ Carbohydrates:
Bảng 1.7: Hàm lượng carbohydrate trong đậu nành [4]
Hàm lượng (%
Carbohydrates trong đậu nành chiếm khoảng
Carbohydrates khối lượng hạt
34% khối lượng khô, trong đó hàm lượng
đậu nành)
tinh bột không đáng kể. Carbohydrates được
chia làm 2 loại:
Cellulose
4.0
Hemicellulose
15.0
Stachyose
3.8
Rafinose
1.1
Saccharose
5.0
–
Loại tan trong nước: chiếm khoảng
10% lượng carbohydrates, gồm các
loại
đường
không
khử
như
saccharose, rafinose và stachyose.
–
Các loại đường 5.1
Loại không tan trong nước: gồm
cellulose, hemicellulose.
khác
™ Chất tro:
Chất tro trong đậu nành từ 4.5–6.8% gồm các chất như: P2O5, K2O, CaO,
MgO, SO3… Ngoài ra còn có các nguyên tố khoáng khác: Al, Fe, I, Mn, Cu, Mo…
™ Vitamine:
Đậu nành chứa nhiều vitamine khác nhau, trừ vitamine C và vitamine D.
Thành phần vitamine như sau:
– 19 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Bảng 1.8 : Thành phần vitamine trong hạt đậu nành [4]
Vitamine
Hàm lượng
Vitamine
Hàm lượng
Thiamin
11–17.5 %
Inositol
2300 mg%
Riboflavin
3.4–3.6 %
Vitamine A
0.18–2.43 %
Niacin
21.4–23 mg/g
Vitamine E
1.4 mg%
Pyridoxine
7.1–12 mg/g
Vitamine K
1.9 mg%
Biotin
0.8 mg/g
Vitamine B1
0.54 mg%
A.patothentic
13–21.5 mg/g
Vitamine B2
0.29 mg%
A.folic
1.9 mg/g
Vitamine PP
2.3 mg%
™ Một số Enzyme trong đậu nành: [4]
–
Urease: đây là enzyme được tìm thấy với hàm lượng lớn ở đậu nành
sống. Nó sẽ phân hủy urea thành ammoniac là một hợp chất độc đôí với
cơ thể người. Urease là vấn đề cần quan tâm khi đậu nành sống trộn với
urea để làm thức ăn cho gia súc. Enzyme này sẽ chống lại sự hấp thụ các
chất đạm qua màng ruột do đó không nên ăn đậu nành sống. Tuy nhiên
urease bò vô hoạt bởi nhiệt. Các vấn đề về enzyme urease sẽ được tìm
hiểu kỹ trong đề tài nghiên cứu này.
–
Lipase: thủy phân glyceride tạo thành glycerin và acid béo.
–
Phospholipase: thủy phân ester của acid phosphoric.
–
Lipoxygenase: xúc tác phản ứng chuyển O2 trong acid béo.
Ngoài ra, đậu nành còn chứa một lượng nước nhất đònh. Hàm ẩm là một yếu
tố rất quan trọng có ảnh hưởng đến khả năng tồn trữ và chế biến. Nếu hàm lượng
ẩm quá cao thì sẽ tốn chí phí để sấy khô hạt. Ngược lại hạt sẽ bò nứt vỡ và làm
giảm giá trò dầu trong hạt. Những nghiên cứu gần đây cho thấy sự oxy hóa chất béo
không chỉ diễn ra trong điều kiện hàm ẩm cao mà còn ở hàm ẩm rất thấp. Hàm ẩm
tối ưu cho việc bảo quản kéo dài là khoảng 12%.
– 20 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.3.
Tách chiết và tinh chế enzyme: [1, 10, 14]
Các enzyme thường có trong các tế bào động thực vật và vi sinh vật và một
số enzyme ngoại bào sẽ có trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Để tách chiết
chúng ra có các cách như sau:
¾ Nghiền tế bào (phá vỡ tế bào):
Có thể dùng phương pháp vật lý hoặc hóa học, sinh học:
• Phương pháp vật lý: các phương pháp xay nghiền ở nhiệt độ
thấp hay dùng Nitơ lỏng. Khi đó nước trong tế bào bò kết tinh
và tăng lực ma sát khi xay nghiền phá vỡ màng tế bào.
• Phương pháp hóa học: xử lý tế bào bằng các dung môi có khả
năng hòa tan màng tế bào. Phần lớn người ta có thể chọn các
dung môi hữu cơ hòa tan được chất béo hoặc xử lý kiềm.
• Phương pháp sinh học: hay còn gọi là phương pháp tự phân
(autolyse). Sử dụng lyxosom trong tế bào để giải phóng các
enzyme phá hủy tế bào hoặc bổ sung các chế phẩm enzyme
phá vỡ màng tế bào.
¾ Trích ly enzyme:
Tùy loại enzyme người ta sẽ chọn dung môi thích hợp để trích ly. Phần lớn
dung môi là các muối loãng hay là dung dòch đệm có pH xác đònh.
¾ Kết tủa enzyme:
Sử dụng các dung môi khác nhau để kết tủa enzyme. Các tác nhân này phải
là các tác nhân biến tính thuận nghòch protein để sau khi kết tủa có thể hòa tan lại
được. Bao gồm:
• Muối trung tính: từng loại protein có thể kết tủa bởi các nồng
độ muối khác nhau. Các muối trung tính thường được chọn là
(NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4, MgCl2, NaCl. Phương pháp này
còn gọi là phương pháp diêm tích.
• Dùng pH đẳng điện (pI): mỗi protein dễ bò kết tủa bởi pH đẳng
điện riêng.
– 21 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
• Dùng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: có khả năng phá màng
hydrate của protein như: butanol, ethanol, polyethylenglycol,
acetone.
¾ Loại tạp chất có phân tử lượng nhỏ:
Bằng phương pháp thẩm tích, dùng các màng bán thấm bằng vật liệu có kích
thước lỗ màng nhỏ có thể cho các chất có phân tử lượng nhỏ đi qua do chênh lệch
áp suất và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn.
¾ Loại protein tạp:
Dùng phương pháp sắc ký, gồm sắc ký hấp phụ hoặc sắc ký trao đổi ion, sắc
ký lọc gel. Hoặc dùng phương pháp điện di: dùng điện trường để tách các protein
tích điện khác nhau.
¾ Làm đặc_tiêu chuẩn hóa sản phẩm:
Dùng sấy thăng hoa hoặc các chế phẩm lỏng được siêu lọc và phải tiêu
chuẩn hóa sản phẩm: chế phẩm phải có hoạt tính riêng nhất đònh.
– 22 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
Dựa trên lý thuyết chung như trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa
ra được nhiều phương pháp tối ưu nhằm thu nhận được nhiều urease. Sau đây là
một số các phương pháp mà chúng tôi tham khảo được:
1.3.1. Phương pháp 1: [22]
–
Chiết xuất: bột đậu
nành sau khi tách béo
được nghiền kỹ trong
dung dòch HCl 0.4%
có thêm 5.10-3 EDTA
và L-cystein. Sau đó
ly tâm bỏ tủa.
–
Xử lý nhiệt: nhiệt độ
của dòch chiết được
nâng nhanh lên đến
600C, giữ 10ph. Sau
đó làm lạnh đến 48oC, giữ trong 30ph, ly
tâm bỏ tủa.
–
Siêu lọc: dòch ly tâm
được xử lý qua màng
siêu lọc để loại peptid và polypeptide có phân tử lượng nhỏ hơn 5000Da.
–
Tủa: Tủa urease bằng acetone: sau khi chạy qua màng siêu lọc, dòch
enzyme được xử lý bằng acetone lạnh với tỷ lệ 1:1. Sau đó ly tâm bỏ
phần dòch, phần tủa được hòa tan lại trong 0.1M Tris-buffer pH=7 chứa
EDTA và L-cystein 5×10-3.
–
Sắc ký trao đổi ion: dòch enzyme được chạy sắc ký trao đổi ion trong cột
chứa DEAE-cellulose với gradient nồng độ NaCl từ 0-1M.
–
Đông khô: enzyme được đông khô với sự hiện diện của saccharose làm
chất ổn đònh với tỷ lệ 2.5mg saccharose cho 1mg enzyme.
– 23 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.3.2. Phương pháp 2: [18]
–
Trích ly: bột đậu nành
sau khi đã tách béo được
cho vào dung dòch đệm A
(20mM
sodium
phosphate, pH 7.5, 1mM
EDTA,
2mM
2_mercaptoethanol)
trong 1h, ở 40C.
–
Ly tâm bỏ bã: 30.000
vòng/ph trong 20ph, 40C.
–
Tủa: acetone lạnh 20%
được bổ sung vào dòch
sau li tâm để loại những
protein tạp. Phần tủa này
cũng sẽ được loại bỏ bằng li tâm ở 30.000v/ph trong 20ph, ở 40C.
–
Thẩm tích: dòch sau bỏ protein tạp sẽ được qua màng thẩm tích trong dung
dòch đệm B (20mM sodium phosphate, pH 7.5, 1mM EDTA, 5mM
2_mercaptoethanol).
–
Dòch thu được sau thẩm tích sẽ cho vào bột Q_Sepharose đã được cân bằng ở
dung dòch đệm B. Sau khi khuấy 30ph, hỗn hợp được đem đi lọc. Bột được
rửa với 150mM NaCl trong dung dòch đệm B để loại bỏ những protein không
bò giữ lại. Phân đoạn làm giàu urease sẽ được thực hiện trong 300mM NaCl
trong đệm B. Và cuối cùng dòch thu được sẽ cho qua cột sắc ký lọc gel và
sắc ký hấp phụ.
– 24 –
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ UREASE
1.3.3. Phương pháp 3: [21]
–
Tất cả các công đoạn của
Xem thêm: Enzyme Pectinase Là Gì
quy trình được thực hiện ở
điều kiện 40C.
–
Trích ly: bột đậu nành sẽ
được trích ly trong dung
dòch
đệm
A
(0.1M
Tris/maleate,
30mM
sodium
10mM
EDTA,
2_mercatoethanol,
pH
7.6). Hỗn hợp được khuấy
trong 3h và để 40C qua
đêm.
–
Li tâm bỏ bã: 16.000
vòng/ph trong 10ph.
–
Gia nhiệt: dòch sau li tâm sẽ gia nhiệt lên 600C trong 1h rồi hạ nhiệt độ về 300C.
–
Kết tủa lần 1: bằng muối ammonium sulfate 20% và được li tâm loại bỏ tủa.
–
Kết tủa lần 2: cũng bằng muối như trên nhưng với nồng độ cao hơn là 55%. Thu
tủa bằng li tâm 16.000v/ph trong 10ph.
–
Hòa tan tủa: sau khi thu kết tủa lần 2 sẽ được tái hòa tan trong dung dòch đệm B
(0.1M Tris/maleate, 1mM sodium EDTA, 10mM 2_mercatoethanol, pH 7.0)
–
Thẩm tích: dòch sau khi được hòa tan sẽ đem thẩm tích trong dung dòch B.
Những protein bò biến tính sẽ được li tâm loại bỏ trong giai đoạn này.
–
Tủa acetone lần 1: cho acetone 50% vào dòch để thu kết tủa.
–
Tủa acetone lần 2: dùng tiếp acetone 33% (chiếm 1/3) để tận thu kết tủa.
–
Tái hòa tan: sau khi thu kết tủa 2 lần sẽ được hòa tan lại trong dung dòch đệm C
(0.1M Tris/maleate, 1mM sodium EDTA, 1mM 2_mercatoethanol, pH 7.0)
–
Thẩm tích: dòch được hòa tan sẽ qua thẩm tích trong dung dòch C và cuối cùng
được chạy sắc ký trên cột DEAE_cellulose.
– 25 –
Hình 1.1 : Enzyme ureaseNhư vậy, từ tên kí hiệu quốc tế của urease, ta hoàn toàn có thể biết được nó là enzymethủy phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân link C-N, khôngphải link peptid theo phương trình như sau [ 44 ] : Urease là enzyme lần tiên phong được J.B.Sumner táchchiết và kết tinh từ đậu rựa ( jack bean_Canavalia ensiformis ) vào năm 1926. Và chính khu công trình điều tra và nghiên cứu này đã đạtgiải Nobel vào năm 1946 đồng thời cũng đăït nền tảng đầutiên cho những khu công trình điều tra và nghiên cứu về urease sau này [ 31 ]. Hình1. 2 : Tinh thể urease đượcJ. B.Summer chiết tách và kết tinh [ 31 ]. – 2 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 1.1. Khối lượng phân tử : [ 21 ] Khối lượng phân tử của urease được nhà nghiên cứu Joseph và Evelyn xácđònh bằng giải pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m và so sánh với những proteinđã biết trước khối lượng phân tử. Kết quả cho thấy urease từ đậu nành có 2 peakứng với 2 phân tử lượng khác nhau đó là 540.000 Da và 420.000 Da, trong khi đóurease từ jack bean chỉ Open 1 peak duy nhất với phân tử lượng là 480.000 Da. Hình 1.3 : Khối lượng phân tử của urease qua cột lọc gel Agarose A_15m [ 21 ] Như vậy, urease từ những nguồn khác nhau có khối lượng phân tử khác nhauvà ngay cả trong cùng một nguồn là đậu nành, có tới 2 loại urease. Hai loại ureasenày khác nhau ở thành phần apoenzyme nhưng thực chất của coenzyme vẫn khôngthay đổi. Các apoenzyme là những chuỗi polypeptide được hình thành từ nhiều acidamin. Thành phần những acid amin này không giống nhau ở những nguồn khác nhauđã lý giải cho sự khác nhau về khối lượng phân tử như đã nói ở trên. – 3 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEBảng 1.1 : Thành phần amino acid của soybean và jack bean urease [ 21 ] a : Dữ liệu do Joseph và Evelyn khảo sát. b : Dữ liệu để so sánh ( do Staples và Reithel khảo sát ). 1.1.2. Trung tâm hoạt động giải trí : [ 23, 26, 30 ] Theo [ 23 ] thì TT hoạt động giải trí của urease có chứa 2 nguyên tử Ni. Mỗinguyên tử Ni này được nối với 2 nguyên tử N trong vòng imidazole và 1 nhómcarboxylate, 1 phân tử H2O ( hình 1.4 ). Và chính 2 nguyên tử Ni này đóng vai trò rấtquan trọng trong việc xúc tác phản ứng của urease. Đó cũng chính là lí do màurease còn được gọi là “ Nikel dependent enzyme ”. Hình 1.4 : Trung tâm hoạt động giải trí của urease ( Ni : 2 quả cầu màu xanh ) [ 23 ] – 4 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASETuy nhiên urease có những nguồn gốc khác nhau như urease từ vi khuẩnBacillus pasteurii trong TT hoạt động giải trí chứa ion sắt kẽm kim loại Zn2 + [ 26 ], còn ởKlebsiella aerogenes có cofactor là Cu2 + [ 30 ] như hình bên dưới : Hình 1.5 : Urease từ K. aerogenes [ 30 ] Hình1. 6 : Urease từ Bacilluspasteurii [ 26 ] 1.1.3. Cơ chế xúc tác : [ 42 ] Cơ chế của quy trình xúc tác phản ứng của urease theo phương trình [ 42 ] : – 5 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASECụ thể xảy ra ở TT hoạt động giải trí như sau : Hình 1.7 : Cơ chế xúc tác của urease [ 42 ] Theo sơ đồ trên ta thấy : bắt đầu phân tử urea sẽ tiến công và tạo link với2 nguyên tử Ni đồng thời có 2 phân tử H2O được giải phóng ra. Tiếp theo là sự sắpxếp lại của những điện tử, hình thành những mối link mới tại TT hoạt động giải trí. Cuối cùng là sự tái cấu trúc ở TT hoạt động giải trí của urease với sự tham gia của 2 phân tử nước, đẩy gốc carbamate ra ngoài đồng thời giải phóng 1 phân tử NH3. Nhưvậy, vai trò của 2 ion sắt kẽm kim loại Ni là rất quan trọng trong việc tạo link giữaenzyme với cơ chất ở quy trình tiến độ tạo phức chất trung gian. Đây chính là một cofactorcủa urease. – 6 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng tác động đến tốc độ phản ứng của urease : [ 1, 10,14, 19, 23, 44 ] 1.1.4. 1. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme : [ 14 ] Nói chung trong điều kiện kèm theo thừa cơ chất, tốc độ phản ứng nhờ vào tuyếnV = k. [ E ] tính vào nồng độ enzyme :: tốc độ phản ứng [ E ] : nồng độ enzymeCũng có trường hợp khi nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản ứng tăngchậm. 1.1.4. 2. nhhưởngcủanồngđộcơchất, Michaelis_Menten : [ 14, 44 ] Phương trình Michaelis_Menten : v = v max × [ S ] K m + [ S ] Trong đó : Km : hằng số Michaelis, là hằng số áilực của enzyme so với cơ chất, đặctrưng của mỗi loại enzyme so với mỗiloại cơ chất. vmax : tốc độ phản ứng đạt cực lớn. [ S ] : nồng độ cơ chấtTừ phương trình ta hoàn toàn có thể xét đến 3 trường hợp : Nếu [ S ] < < Km thì : v = v max × [ S ] KmNhư vậy, ở nồng độ cơ chất thấp, v nhờ vào tuyến tính vào [ S ] - 7 - môhìnhCHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASENếu [ S ] >> Km thì : v = vmax : tức tốc độ phản ứng đạt cực lớn, không phụthuộc [ S ]. Như vậy [ S ] đã đủ lớn đến mức nào đó, nếu liên tục tăng [ S ], vcũng không tăng theo. Nếu [ S ] = Km thì v = v max : tốc độ phản ứng bằng nửa tốc độ cực lớn. Hoặc ta cũng hoàn toàn có thể xác đònh Km vàVmax theo phương trình được viết lại từ phươngtrình trên như sau : + m × vi v max v max [ S ] Từ đó ta sẽ màn biểu diễn sự nhờ vào củatheobằng một phương trình đườngvi [ S ] thẳng và xác đònh Km, Vmax như đồ thò bên. Trên cơ sở đó, một thí nghiệm của trường ĐH Regensburg ( Đức ) việcxác đònh Km, Vmax có tác dụng như sau [ 44 ] : Kết quả suy ra từ đồ thò ( hình 1.8 ) : 400C500 CKm ( mol. L-1 ) 2.41 * 10-22. 41 * 10-2 Vmax ( mS. min-1 ) 0.51180.7868 – 8 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEHình 1.8 : Đồ thò xác đònh Km và Vmax ở hai nhiệt độ khác nhau [ 44 ] ( 1 ) : ở 400C1. 1.4.3. ( 2 ) : 500C nh hưởng của nhiệt độ : [ 14, 17, 23, 44 ] Giống như phản ứng hóa học, khi nhiệt độ tăng, tốc độ hoạt động củacác phân tử tăng, sự tiếp xúc giữa những phân tử cũng tăng nên tốc độ phản ứngtăng. Tuy nhiên do thực chất enzyme là protein nên nhiệt độ cao sẽ làm biến tínhprotein, enzyme mất hoạt tính. Do đó, mỗi enzyme sẽ sống sót một nhiệt độ mà ở đóhoạt tính cao nhất, gọi là : nhiệt độ tối thích topt. Theo những điều tra và nghiên cứu từ đậu rựa ( jack bean ) thì nhiệt độ topt vào tầm 4550 C [ 17 ]. Tuy nhiên nhiệt độ topt của urease không cố đònh, mà nó nhờ vào vàonhiều yếu tố như : nguồn thu nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gianphản ứng … Người ta đã thấy rằng độ bền nhiệt của urease tăng khi xuất hiện cơ chất hoặcL_cystein và urease ở dung dòch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệtnhất, còn ở dạng bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [ 23 ]. nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng không bò biến tính. – 9 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEtoptCũng là một thí nghiệm của trường ĐH Regensburg ( Đức ) đã xác đònhđược thực thi dưới thiết bò sau [ 44 ] : Hình 1.9 : Thiết bò thí nghiệm xác đònh topt của urease [ 44 ] Theo sơ đồ trên, nhiệt độ sẽ được đo ở ( 2 ) với sự trợ giúp của tế bào bán dẫn ( 1 ) và toàn bộ được nối với bộ điều kiển gọi là CHEMBOX. Nhiệt độ sẽ được khảosát ở 20, 30, 40, 50, 600C. Kết quả thu được của những nhà nghiên cứu này là topt = 500C như đồ thò hình bên : Hình 1.10 : Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính urease [ 44 ] – 10 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 1.4.4. Ảnh hưởng của pH : [ 14, 19 ] Enzyme rất nhạy cảm với sự biến hóa pH của thiên nhiên và môi trường do pH ảnh hưởng tác động đếnsự phân ly ion của phân tử cơ chất. Do đó mỗi enzyme có một pH mà hoạt tính củanó đạt cực lớn, gọi là pH tối thích ( pHopt ). Khi pH càng xa pHopt thì hoạt tính cànggiảm [ 2 ]. Bảng 1.2 : Giá trò pHopt ở những loại đệm [ 19 ] Nồngđộ Loại đệmpHopturea 8 % và bằng 7.5 khi nồng độ urea làurea ( % ) 2.50.1 Urease có pHopt = 6 khi nồng độ cơ chấtAcetate6. 41 % [ 19 ]. Điều này cho thấy giá trò pH tốiCitrate6. 5 ưu của urease cũng không cố đònh mà nóPhosphate6. 9 còn nhờ vào vào nồng độ cơ chất, nhiệtAcetate6. 7 độ cũng như vào nguồn nguyên vật liệu thuCitrate6. 7 nhận. Phosphate7. 6T heo những tài liệu thì giá trò pH tối ưu củaurease nằm trong khoảng chừng 6.4 – 7.6. Như vậy, hoạt tính của urease phụ thuộc vào vàodung dòch đệm, giá trò pH, nồng độ urea, nhiệt độ và nồng độ muối ( bảng 1.2 ). Hình 1.11 : Giá trò pHopt ở nồng độ urea 2.5 % của những loại đệm [ 19 ] – 11 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 1.4.5. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất ức chế : [ 10, 14, 23, 27 ] Mỗi enzyme đều sống sót 1 số ít hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặtcủa chúng có năng lực kích thích hoặc ngưng trệ hoạt động giải trí của enzyme, gọi là chấtkích thích ( chất hoạt hóa ) và chất ngưng trệ ( chất ức chế ). Tuy nhiên không có sựphân biệt rõ ràng chất ức chế và ngưng trệ vì một chất hoàn toàn có thể là kích thích vớienzyme này nhưng là ngưng trệ của enzyme khác hoặc ở nồng độ này là kích thích, nồng độ khác là ngưng trệ [ 14 ]. ™ Cơ chế tác dụng của chất hoạt hóa : [ 14 ] Các chất hoạt hóa hoàn toàn có thể là chất biến enzyme từ trạng thái không hoạt độngsang trạng thái hoạt động giải trí, hoàn toàn có thể là những chất dò lập thể dương hoặc những chất có khảnăng biến tiền enzyme không hoạt động giải trí sang hoạt động giải trí mạnh. Các chất này có thểlà những ion sắt kẽm kim loại, hoàn toàn có thể đóng vai trò nhóm ngoại của những enzyme 2 cấu tử hoặctham gia vào cấu trúc của coenzyme, hoặc là cầu nối giữa enzyme với cơ chất, hoặclà cầu nối giữa phần apoenzyme với coenzyme. ™ Cơ chế tác dụng của chất ngưng trệ : [ 14 ] Các chất ngưng trệ ngược lại là những chất có công dụng biến enzyme từ trạngthái hoạt động giải trí sang không hoạt động giải trí, hoặc từ trạng thái hoạt động giải trí mạnh sang hoạtđộng yếu. Các chất này hoàn toàn có thể là dò lập thể âm, sống sót hai loại ngưng trệ : cạnhtranh và không cạnh tranh đối đầu. Kìm hãm cạnh tranh đối đầu : xảy ra trong trườnghợp chất ngưng trệ có cấu trúc tương đồngvới cơ chất, vì thế cũng có năng lực kếthợp với enzyme, giảm mối link giữaenzyme và cơ chất. Kìm hãm không cạnh tranh đối đầu : xảy ra trongtrường hợp chất ngưng trệ có năng lực kếthợp với enzyme hoặc cơ chất, hoàn toàn có thể là ionkim loại cùng hóa trò với những ion kimloại là nhóm ngoại của enzyme. Hình 1.12 : Ảnh hưởng của chất kìm hãmcạnh tranh và không cạnh tranh đối đầu. – 12 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASETheo [ 28 ], những ion sắt kẽm kim loại như Hg2 +, Cu2 +, Pb2 +, Mn2 + … là những chất kìmhãm không cạnh tranh đối đầu vì nó có hóa trò cùng với cofactor của urease là Ni2 +. Các ionkim loại này sẽ tranh giành những link với Ni2 +, và do đó sẽ làm “ khóa ” ù trung tâmhoạt động của urease. Bảng 1.3 : Ảnh hưởng của những chất ức chế lên hoạt tính urease [ 28 ] Theo bảng trên, với hàm lượng AgNO3 0.002 mg / ml đã làm mất hoạt tính củaurease, so với HgCl2 là 0.004 mg / ml và so với Cu2 + là 0.01 mg / ml. Ngoài ra, hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid lànhững chất ức chế đặc hiệu cạnh tranh đối đầu của urease. Vì chúng có cấu trúc gần giốngcơ chất nên chúng cũng có năng lực tích hợp với enzyme. Do đó sự xuất hiện củachúng trong dung dòch làm giảm vận tốc phản ứng thủy phân urea. Có thể làm giảmtác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea [ 23 ]. ™ Ví dụ với chất ức chế là hydroxamic acid [ 23 ] : – 13 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASECụ thể như sau : Hình 1.13 : Cơ chế ức chế của hydroxamic acid với urease [ 23 ] Hydroxamic acid do có cấu trúc gần giống urea nên nó tiến công vào trungtâm hoạt động giải trí của urease là 2 quả cầu Ni và đã “ khóa ” chặt 2 quả cầu này. – 14 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 2. Các chiêu thức thu nhận urease : 1.2.1. Nguồn thu nhận : [ 8, 9, 11, 17, 21, 24, 31 ] Urease được những nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệukhác nhau. Vào năm 1876, Musculus lần tiên phong trình diễn báo cáo giải trình về enzyme urease. Ông lọc lấy vi trùng trên giấy lọc, làm khô giấy, sau đó thấm ướt bằng dung dòchchỉ thò acid_base để kiểm tra urea. Ông cũng tìm thấy urease có trong nước tiểu [ 8 ]. Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là trong cácvi sinh vật đất, trong thực vật và 1 số ít ít ở động vật hoang dã. Ông đã tìm ra ở hơn 200 loàivi khuẩn, nhiều loại nấm men và ở đa phần những loại thực vật bậc cao. Các vi trùng cóchứa urease tham gia vào quy trình đồng nhất urea thành muối amon có nhiều loài, chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ : Cocoaceae vàBacilaceae [ 31 ]. Năm 1922, Przylecki tìm thấy urease trong gan của động vật hoang dã thân mềm, trong một số ít loài ấu trùng và loài giáp xác. Ngoài ra urease còn được tìm thấy ởcon Sam ( Limulus polyphemus ) và ở ấu trùng của ruồi Lucilia sericata [ 31 ]. Các loại cây họ Đậu như đậu rựa, đậu nành, đậu ngự, đậu rằn đều có chứamột lượng đáng kể urease. Trong những loại đậu kể trên thì đậu rựa ( jack bean ) chứamột lượng urease rất lớn, tới gần 20 % khối lượng chất khô của hạt [ 31 ]. Đậu rựa có nguồn gốc từ Ấn Độ. Ở nước ta, giống đậu rựa được trồng nhiềuở miền Bắc, ở miền Nam có giống đậu rựa leo. Hạt đậu rựa độc, ăn say do tronghạt có chứa chất Concanavalin là chất độc. Nó phân lập immunoglobulin vàglucoprotein trong máu, làm giảm năng lực hấp thu chất dinh dưỡng qua ruột non [ 9 ]. Vì lí do trên nên ở nước ta đậu rựa ít được trồng nhiều. So với 3 loại đậu còn lại : đậu rằn, đậu ngự, đậu nành thì đậu nành có chứamột lượng urease lớn hơn cả và cho hoạt tính cao hơn 2 loại còn lại [ 8 ]. Đậu nànhdo có giá trò dinh dưỡng cao nên được trồng khá thông dụng ở nước ta, giá tiền lại rẻnên rất thích hợp được dùng làm nguyên vật liệu để nghiên cứu và điều tra thu nhận urease trongkhuôn khổ luận văn này. – 15 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 2.1.1. Cây đậu nành ( Glycine max Merill ) : [ 5, 7, 9, 37 ] Cây đậu nành là một trong số cây xanh có lòch sử truyền kiếp nhất của loài người. Theo thống kê của FAO ( 1994 ), đậu nành được phân loại thực vật học như sau : Bảng 1.4 : Phân loại thực vật học của cây đậu nành [ 37 ] Phân giớiCormobinataHọLeguminosaePhân loạiSpermatophytaPhân họPapilionaceaeTôngPhaseoleaePhân hiệu ( chi ) AngcospermaeLớpDicotyldoneeaePhân tôngPhaseolinae GlycininaePhân lớpArchichlamydaeGiốngGlycine LThứRosalesPhân giốngGlycine Subg, SojaPhân họLeguminosinaeLoàiGlycine maxHình 1.14 : Cây đậu nành, quả và hạt [ 37 ] – 16 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 2.1.2. Hạt đậu nành : [ 5, 7, 9, 37 ] Hạt đậu nành, cũng như hạt của nhiều họ đậu khác, không có nội nhũ mà chỉcó một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Tùy theo giống, hình dạng của hạt có thểbiến đổi từ hình cầu, dẹt, dài và hầu hết là có hình ô van [ 7 ]. Hạt đậu nành gồm ba bộ phận [ 7 ] : Vỏ hạt chiếm 8 % khối lượng hạt. Rốn hạt chiếm 2 % khối lượng hạt. Phôi trưởng thành gồm hai lá mầm chiếm 90 % khối lượng hạt. Hình 1.15 : Cấu tạo của hạt và phôi đậu nành [ 37 ] 1.2.1. 3. Thành phần hóa học của đậu nành : [ 4, 7 ] Đậu nành được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để xử lý nạnthiếu protein trong dinh dưỡng của con người. Ngoài ra, đậu nành còn được dùng đểchữa bệnh tiểu đường, suy nhược thần kinh, suy nhược dinh dưỡng [ 7 ]. Đậu nành có nhiều sắc tố khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng làtốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều [ 7 ]. – 17 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEBảng1. 5 : Thành phần hóa học của đậu nành tính trên tổng khối lượng hạt [ 4 ] Thành phần hóa học % Khối lượngProtein40. 0C hất béo20. 0C arbohydrateCellulose4. 0H emicellulose15. 0 ĐườngStachyose3. 8R afinose1. 1S accharose5. 0 Đường khác ( arabinose, glucose … ) 5.1 Viatamin và khoáng6. 0 ™ Protein : Hàm lượng protein tổng giao động trong hạt đậu nành từ 29.6 – 50.5 %, trungbình là 36 – 40 %. Các nhóm protein đơn thuần ( % so với tổng số protein ) : albumin ( 6 – 8 % ), globulin ( 25 – 34 % ), glutelin ( 13 – 14 % ), prolamin chiếm lượng nhỏ khôngđáng kể. Gần 80 % protein có trong hạt hoàn toàn có thể tách riêng ra ngoài nhờ vào phươngpháp sử dụng kiềm. ™ Lipid : Chất béo trong đậu nành xê dịch từ 13.5 – 24 % theo hàm lượng chất khô, trung bình 18 %. Chất béo chứa khoảng chừng 6.4 – 15.1 % acid béo no ( acid stearic, acidarachidic ) và 80 – 93.6 % acid béo không no ( acid linoleic, acid linolenic, acid oleictrong đó acid linolenic chiếm tỷ suất tương đối cao ). Chất béo không no có lợi chosức khỏe hơn là acid béo no. Tuy nhiên những acid béo không no dễ bò oxy hóa vàlàm giảm chất lượng dầu nành. Dầu nành được tiêu hóa thuận tiện với thành phần những acid béo không no, không có cholesterol và những acid béo không thay thế sửa chữa như acid linoleic, acidlinolenic và acid arachidonic … có vai trò sinh học cao so với con người. – 18 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEBảng 1.6 : Hàm lượng acid béo trong đậu nành [ 4 ] Acid béo noHàm lượng ( % ) Acid béo không noHàm lượng ( % ) Lauric C12 : 00-0. 2P almitoleic C16 : 10.42 – 1.6 Myristic C14 : 00.1 – 0.4 Oleic C18 : 110.9 – 60P almitic C16 : 05.5 – 6.5 Linoleic C18 : 225 – 64.8 Stearic C18 : 02.4 – 5.5 Arachidonic C20 : 4A rachidic C20 : 00.2 – 0.9 Linolenic C18 : 30.3 – 12.1 Behenic C22 : 0T ổng cộng15Tổng cộng85 ™ Carbohydrates : Bảng 1.7 : Hàm lượng carbohydrate trong đậu nành [ 4 ] Hàm lượng ( % Carbohydrates trong đậu nành chiếm khoảngCarbohydrates khối lượng hạt34 % khối lượng khô, trong đó hàm lượngđậu nành ) tinh bột không đáng kể. Carbohydrates đượcchia làm 2 loại : Cellulose4. 0H emicellulose15. 0S tachyose3. 8R afinose1. 1S accharose5. 0L oại tan trong nước : chiếm khoảng10 % lượng carbohydrates, gồm cácloạiđườngkhôngkhửnhưsaccharose, rafinose và stachyose. Các loại đường 5.1 Loại không tan trong nước : gồmcellulose, hemicellulose. khác ™ Chất tro : Chất tro trong đậu nành từ 4.5 – 6.8 % gồm những chất như : P2O5, K2O, CaO, MgO, SO3 … Ngoài ra còn có những nguyên tố khoáng khác : Al, Fe, I, Mn, Cu, Mo … ™ Vitamine : Đậu nành chứa nhiều vitamine khác nhau, trừ vitamine C và vitamine D.Thành phần vitamine như sau : – 19 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEBảng 1.8 : Thành phần vitamine trong hạt đậu nành [ 4 ] VitamineHàm lượngVitamineHàm lượngThiamin11 – 17.5 % Inositol2300 mg % Riboflavin3. 4 – 3.6 % Vitamine A0. 18 – 2.43 % Niacin21. 4 – 23 mg / gVitamine E1. 4 mg % Pyridoxine7. 1 – 12 mg / gVitamine K1. 9 mg % Biotin0. 8 mg / gVitamine B10. 54 mg % A.patothentic 13 – 21.5 mg / gVitamine B20. 29 mg % A.folic 1.9 mg / gVitamine PP2. 3 mg % ™ Một số Enzyme trong đậu nành : [ 4 ] Urease : đây là enzyme được tìm thấy với hàm lượng lớn ở đậu nànhsống. Nó sẽ phân hủy urea thành ammoniac là một hợp chất độc đôí vớicơ thể người. Urease là yếu tố cần chăm sóc khi đậu nành sống trộn vớiurea để làm thức ăn cho gia súc. Enzyme này sẽ chống lại sự hấp thụ cácchất đạm qua màng ruột do đó không nên ăn đậu nành sống. Tuy nhiênurease bò vô hoạt bởi nhiệt. Các yếu tố về enzyme urease sẽ được tìmhiểu kỹ trong đề tài điều tra và nghiên cứu này. Lipase : thủy phân glyceride tạo thành glycerin và acid béo. Phospholipase : thủy phân ester của acid phosphoric. Lipoxygenase : xúc tác phản ứng chuyển O2 trong acid béo. Ngoài ra, đậu nành còn chứa một lượng nước nhất đònh. Hàm ẩm là một yếutố rất quan trọng có tác động ảnh hưởng đến năng lực tồn trữ và chế biến. Nếu hàm lượngẩm quá cao thì sẽ tốn chí phí để sấy khô hạt. Ngược lại hạt sẽ bò nứt vỡ và làmgiảm giá trò dầu trong hạt. Những nghiên cứu và điều tra gần đây cho thấy sự oxy hóa chất béokhông chỉ diễn ra trong điều kiện kèm theo hàm ẩm cao mà còn ở hàm ẩm rất thấp. Hàm ẩmtối ưu cho việc dữ gìn và bảo vệ lê dài là khoảng chừng 12 %. – 20 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 3. Tách chiết và tinh chế enzyme : [ 1, 10, 14 ] Các enzyme thường có trong những tế bào động thực vật và vi sinh vật và mộtsố enzyme ngoại bào sẽ có trong môi trường tự nhiên nuôi cấy vi sinh vật. Để tách chiếtchúng ra có những cách như sau : ¾ Nghiền tế bào ( phá vỡ tế bào ) : Có thể dùng giải pháp vật lý hoặc hóa học, sinh học : • Phương pháp vật lý : những chiêu thức xay nghiền ở nhiệt độthấp hay dùng Nitơ lỏng. Khi đó nước trong tế bào bò kết tinhvà tăng lực ma sát khi xay nghiền phá vỡ màng tế bào. • Phương pháp hóa học : giải quyết và xử lý tế bào bằng những dung môi có khảnăng hòa tan màng tế bào. Phần lớn người ta hoàn toàn có thể chọn cácdung môi hữu cơ hòa tan được chất béo hoặc giải quyết và xử lý kiềm. • Phương pháp sinh học : hay còn gọi là giải pháp tự phân ( autolyse ). Sử dụng lyxosom trong tế bào để giải phóng cácenzyme tàn phá tế bào hoặc bổ trợ những chế phẩm enzymephá vỡ màng tế bào. ¾ Trích ly enzyme : Tùy loại enzyme người ta sẽ chọn dung môi thích hợp để trích ly. Phần lớndung môi là những muối loãng hay là dung dòch đệm có pH xác đònh. ¾ Kết tủa enzyme : Sử dụng những dung môi khác nhau để kết tủa enzyme. Các tác nhân này phảilà những tác nhân biến tính thuận nghòch protein để sau khi kết tủa hoàn toàn có thể hòa tan lạiđược. Bao gồm : • Muối trung tính : từng loại protein hoàn toàn có thể kết tủa bởi những nồngđộ muối khác nhau. Các muối trung tính thường được chọn là ( NH4 ) 2SO4, Na2SO4, MgSO4, MgCl2, NaCl. Phương pháp nàycòn gọi là giải pháp diêm tích. • Dùng pH đẳng điện ( pI ) : mỗi protein dễ bò kết tủa bởi pH đẳngđiện riêng. – 21 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE • Dùng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp : có năng lực phá mànghydrate của protein như : butanol, ethanol, polyethylenglycol, acetone. ¾ Loại tạp chất có phân tử lượng nhỏ : Bằng giải pháp thẩm tích, dùng những màng bán thấm bằng vật tư có kíchthước lỗ màng nhỏ hoàn toàn có thể cho những chất có phân tử lượng nhỏ đi qua do chênh lệcháp suất và giữ lại những chất có phân tử lượng lớn. ¾ Loại protein tạp : Dùng chiêu thức sắc ký, gồm sắc ký hấp phụ hoặc sắc ký trao đổi ion, sắcký lọc gel. Hoặc dùng chiêu thức điện di : dùng điện trường để tách những proteintích điện khác nhau. ¾ Làm đặc_tiêu chuẩn hóa loại sản phẩm : Dùng sấy thăng hoa hoặc những chế phẩm lỏng được siêu lọc và phải tiêuchuẩn hóa mẫu sản phẩm : chế phẩm phải có hoạt tính riêng nhất đònh. – 22 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASEDựa trên kim chỉ nan chung như trên, những nhà khoa học đã nghiên cứu và điều tra và đưara được nhiều chiêu thức tối ưu nhằm mục đích thu nhận được nhiều urease. Sau đây làmột số những chiêu thức mà chúng tôi tìm hiểu thêm được : 1.3.1. Phương pháp 1 : [ 22 ] Chiết xuất : bột đậunành sau khi tách béođược nghiền kỹ trongdung dòch HCl 0.4 % có thêm 5.10 – 3 EDTAvà L-cystein. Sau đóly tâm bỏ tủa. Xử lý nhiệt : nhiệt độcủa dòch chiết đượcnâng nhanh lên đến600C, giữ 10 ph. Sauđó làm lạnh đến 48 oC, giữ trong 30 ph, lytâm bỏ tủa. Siêu lọc : dòch ly tâmđược giải quyết và xử lý qua màngsiêu lọc để loại peptid và polypeptide có phân tử lượng nhỏ hơn 5000D a. Tủa : Tủa urease bằng acetone : sau khi chạy qua màng siêu lọc, dòchenzyme được giải quyết và xử lý bằng acetone lạnh với tỷ suất 1 : 1. Sau đó ly tâm bỏphần dòch, phần tủa được hòa tan lại trong 0.1 M Tris-buffer pH = 7 chứaEDTA và L-cystein 5×10 – 3. Sắc ký trao đổi ion : dòch enzyme được chạy sắc ký trao đổi ion trong cộtchứa DEAE-cellulose với gradient nồng độ NaCl từ 0-1 M.Đông khô : enzyme được đông khô với sự hiện hữu của saccharose làmchất ổn đònh với tỷ suất 2.5 mg saccharose cho 1 mg enzyme. – 23 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 3.2. Phương pháp 2 : [ 18 ] Trích ly : bột đậu nànhsau khi đã tách béo đượccho vào dung dòch đệm A ( 20 mMsodiumphosphate, pH 7.5, 1 mMEDTA, 2 mM2_mercaptoethanol ) trong 1 h, ở 40C. Ly tâm bỏ bã : 30.000 vòng / ph trong 20 ph, 40C. Tủa : acetone lạnh 20 % được bổ trợ vào dòchsau li tâm để loại nhữngprotein tạp. Phần tủa nàycũng sẽ được vô hiệu bằng li tâm ở 30.000 v / ph trong 20 ph, ở 40C. Thẩm tích : dòch sau bỏ protein tạp sẽ được qua màng thẩm tích trong dungdòch đệm B ( 20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM2_mercaptoethanol ). Dòch thu được sau thẩm tích sẽ cho vào bột Q_Sepharose đã được cân đối ởdung dòch đệm B. Sau khi khuấy 30 ph, hỗn hợp được đem đi lọc. Bột đượcrửa với 150 mM NaCl trong dung dòch đệm B để vô hiệu những protein khôngbò giữ lại. Phân đoạn làm giàu urease sẽ được thực thi trong 300 mM NaCltrong đệm B. Và ở đầu cuối dòch thu được sẽ cho qua cột sắc ký lọc gel vàsắc ký hấp phụ. – 24 – CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN VỀ UREASE1. 3.3. Phương pháp 3 : [ 21 ] Tất cả những quy trình củaquy trình được triển khai ởđiều kiện 40C. Trích ly : bột đậu nành sẽđược trích ly trong dungdòchđệm ( 0.1 MTris / maleate, 30 mMsodium10mMEDTA, 2 _mercatoethanol, pH7. 6 ). Hỗn hợp được khuấytrong 3 h và để 40C quađêm. Li tâm bỏ bã : 16.000 vòng / ph trong 10 ph. Gia nhiệt : dòch sau li tâm sẽ gia nhiệt lên 600C trong 1 h rồi hạ nhiệt độ về 300C. Kết tủa lần 1 : bằng muối ammonium sulfate 20 % và được li tâm vô hiệu tủa. Kết tủa lần 2 : cũng bằng muối như trên nhưng với nồng độ cao hơn là 55 %. Thutủa bằng li tâm 16.000 v / ph trong 10 ph. Hòa tan tủa : sau khi thu kết tủa lần 2 sẽ được tái hòa tan trong dung dòch đệm B ( 0.1 M Tris / maleate, 1 mM sodium EDTA, 10 mM 2 _mercatoethanol, pH 7.0 ) Thẩm tích : dòch sau khi được hòa tan sẽ đem thẩm tích trong dung dòch B.Những protein bò biến tính sẽ được li tâm vô hiệu trong tiến trình này. Tủa acetone lần 1 : cho acetone 50 % vào dòch để thu kết tủa. Tủa acetone lần 2 : dùng tiếp acetone 33 % ( chiếm 1/3 ) để tận thu kết tủa. Tái hòa tan : sau khi thu kết tủa 2 lần sẽ được hòa tan lại trong dung dòch đệm C ( 0.1 M Tris / maleate, 1 mM sodium EDTA, 1 mM 2 _mercatoethanol, pH 7.0 ) Thẩm tích : dòch được hòa tan sẽ qua thẩm tích trong dung dòch C và cuối cùngđược chạy sắc ký trên cột DEAE_cellulose. – 25 –
Source: https://blogchiase247.net
Category: Hỏi Đáp
